Abbexa  abx151519說明書

人成纖維細胞生長因子19(FGF19)ELISA試劑盒

 目錄號：abx151519

尺寸：96T

范圍：15.6 pg/mL-1000 pg/mL

靈敏度：< 5.7 pg/mL

儲存：96孔板、標準品和檢測試劑在-20 ℃下儲存，試劑盒的其余部分在4 ℃下儲存。

應用：定量檢測人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清液等生物體液中的FGF19。

檢測原理：本試劑盒基于夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗技術。將抗體預包被在96孔板上。向孔中加入標準品、供試品和生物素結合試劑并孵育。然后加入HRP結合試劑，并孵育整個平板。在每個階段使用洗滌緩沖液除去未結合的結合物。TMB底物用于定量HRP酶促反應。加入TMB底物后，只有含有足量FGF19的孔才會產生藍色產物，然后加入酸性終止液后變?yōu)辄S色。黃色強度與平板上結合的FGF19量成正比。采用分光光度法在酶標儀中測定450 nm處的光密度(OD)，據此計算FGF19的濃度。

試劑盒組分

• 預包被96孔微孔板：12 x 8

• 標準品：2管

• 標準稀釋緩沖液：20 mL

• 沖洗緩沖液：(30X)20 mL

• 檢測試劑A：(100X)120 μL

• 檢測試劑B：(100X)120 μL

• 稀釋劑A：12 mL

• 稀釋劑B：12 mL

• TMB底物：9 mL

• 終止液：6 mL

• 封板機：4

需要但未提供的材料

• 37 °C培養(yǎng)箱

• 多通道和單通道移液器和無菌移液器吸頭

• 噴射瓶或自動微孔板洗板機

• 1.5 mL試管

• 蒸餾水

• 吸水性濾紙

• 100 mL和1 l量筒

• 0.01 mol/L PBS(pH 7.0-7.2)

• 酶標儀（波長：450 nm）

• ELISA振蕩器

方案

A. 樣品制備

立即分析或在2-8 ℃下儲存樣品（24 h內）。對于長期儲存，等分并儲存在-20 ℃或-80 ℃下。避免多次凍融循環(huán)。

血清：應將樣本采集至血清分離管中。將試管垂直放置在4 ℃下過夜或在室溫下靜置1 h，凝固血清。以約1000×g離心20分鐘。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。立即測定或等分并儲存在-20 ℃或-80 ℃下。

血漿：使用EDTA或肝素作為抗凝劑采集血漿。采集后30分鐘內，以1000 xg離心15分鐘。如果出現(xiàn)沉淀，再次離心。避免使用溶血樣本。

組織勻漿：組織勻漿的制備因組織類型而異-這只是一個例子。用冰冷PBS沖洗組織，以除去過量血液。均質化前稱重。將組織切碎，在冰上用組織勻漿器在PBS中勻漿化，并對細胞懸液進行超聲處理。以5000×g離心勻漿5分鐘，收集上清液。

細胞裂解液：用胰蛋白酶分離貼壁細胞，離心收集，除去上清液。在冰冷PBS中清洗細胞3次，并在PBS中重懸細胞。超聲裂解細胞4次，或-20 ℃冷凍，解凍至室溫3次。在2-8 ℃下以1500×g離心10分鐘，除去細胞碎片。收集上清液。

細胞培養(yǎng)上清液：以約1000×g離心20分鐘，除去沉淀。

其他生物液體：以約1000×g離心20分鐘，除去沉淀。立即分析或分裝并儲存在-20 ℃或-80 ℃下。

備注：

必須稀釋樣本，使預期濃度在試劑盒范圍內。用0.01 mol/L PBS(PH = 7.0-7.2)稀釋樣品。

始終使用無熱原、無內毒素的采血管采集血液。

建議使用新鮮樣本或近期獲得的樣本，以防止可能導致錯誤結果的蛋白質降解和變性。

NaN3不能用作供試品防腐劑，因為它抑制HRP。

如果手冊申請中未指明樣本，則需要進行初步實驗以確定試劑盒的適用性。

B. 試劑制備

標準品溶液：用1.0 mL標準稀釋緩沖液制備標準品溶液，制備4000 pg/mL標準品溶液。將復溶的標準品靜置10分鐘，輕輕攪拌，然后進行系列稀釋。避免產生泡沫或氣泡。進一步稀釋4倍得到高濃度標準品1000 pg/mL。在用于系列稀釋的試管上貼上標簽-參見下圖以供參考。向各試管中等分0.5 mL標準品稀釋劑緩沖液（高濃度標準品試管除外）。向第1支試管中加入0.5 mL高濃度標準品溶液，充分混勻。從第1個試管轉移0.5 mL至第2個試管，充分混勻，以此類推。

注：復溶期間不得渦旋標準品，因為這會使蛋白質不穩(wěn)定。標準品復溶后，應在15分鐘內使用。不建議重復使用復溶的標準品。

清洗緩沖液：用蒸餾水將濃縮清洗緩沖液稀釋30倍(1/30)（即，將20 mL濃縮清洗緩沖液加入580 mL蒸餾水中）。如果在濃縮清洗緩沖液中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。

檢測試劑A工作溶液制備：實驗前制備不超過15分鐘。

1. 計算所需工作溶液的總體積。

2. 用稀釋劑A將檢測試劑A稀釋100倍，充分混勻。移液器動作緩慢、平穩(wěn)，可減少體積誤差。

檢測試劑B工作溶液制備：在實驗前制備不超過15分鐘。

1. 計算所需工作溶液的總體積。

2. 用稀釋劑B將檢測試劑B稀釋100倍，充分混勻。移液器動作緩慢、平穩(wěn)，可減少體積誤差。

C. 試驗方案

按照上文所述制備所有標準品、樣品和試劑。使用前，將試劑盒組分和樣本平衡至室溫。建議重復測量兩次，并繪制每個試驗的標準曲線。

• 在預包被板上分別設置標準孔、供試品孔和對照（零）孔，記錄其位置。在不接觸側壁的情況下，將溶液添加到每個孔的底部。在加入到孔中之前，將標準品和樣品上下吸移混勻。避免產生泡沫或氣泡。

2. 將100 μL稀釋標準品等分至標準品孔中。

3. 將100 μL標準稀釋緩沖液等分至對照（零）孔中。

4. 將100 μL適當稀釋的樣品等分至供試品孔中。輕敲微孔板混勻，或使用微孔板振蕩器。

5. 用封板覆膜覆蓋微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

6. 取下蓋子，棄去液體。請勿清洗。

7. 向各孔中分裝100µl檢測試劑A工作溶液。用封板覆膜覆蓋微孔板，并在37 ℃下孵育1 h。

• 取下蓋子，棄去溶液。用清洗緩沖液清洗微孔板3次。使用多通道移液器或自動清洗器，用清洗緩沖液(300 μL)*填充每個孔（建議浸泡1-2分鐘）。每個步驟*去除液體對于良好性能至關重要。終清洗后，通過抽吸或傾析除去任何剩余的清洗緩沖液。倒置微孔板，在干凈的吸水紙巾上吸干。

9. 向各孔中分裝100µl檢測試劑B工作溶液。密封平板，并在37 ℃下孵育30分鐘。

10. 取下蓋子，棄去溶液，重復步驟8中描述的清洗過程5次。

• 向各孔中分裝90 μL TMB底物。用封板覆膜覆蓋微孔板。輕輕敲擊微孔板使其充分混合。在37 ℃下孵育10 min。孵育時間僅供參考，終用戶應確定宜時間。避免暴露于光照下。

12. 向各孔中分裝50µl終止液。重要的是，在整個微孔板中快速均勻地混合終止液，以*滅活酶。

13. 確保平板底部沒有指紋或水，孔中的液體無氣泡。立即測量450 nm處的OD。

計算時，取各參比標準品和各樣品的OD 450讀數的平均值，然后減去平均對照（零）OD讀數。

（相對OD）=（每個孔的OD）-（零孔的OD）

以各參比標準品溶液(X)的相對OD對各標準品溶液(Y)的相應濃度繪制標準曲線。可根據標準曲線內插樣品濃度。如果測定的樣品被稀釋，則將內插得到的濃度乘以稀釋因子，得到稀釋前的濃度。

注意事項：

使用試劑盒前，離心試管，使蓋中的內容物減少。

在兩次孵育之間，請勿長時間暴露微孔。每個步驟的試劑添加時間不得超過10分鐘。

在孵育步驟期間，確保平板正確密封或覆蓋，并且時間和溫度受控。

請勿重復使用移液器槍頭和試管。

請勿使用過期組件或來自不同套件的組件。

TMB底物應在無菌條件下使用，并盡量減少光暴露。未使用的底物應為無色或淺黃色。請勿將任何殘留溶液丟棄回小瓶中。

請注意，該試劑盒經過優(yōu)化，可用于檢測天然樣本，而不是重組蛋白或合成化學品。我們無法保證重組蛋白的檢測，因為它們可能與天然蛋白具有不同的序列或三級結構。

精密度：

試驗內精密度（試驗內精密度）：3份含低、中和高水平FGF19的樣本分別在一個平板上檢測20次。

試驗間精密度（試驗間精密度）：在3個不同平板上檢測低、中和高水平FGF19的3份樣本，每個平板8份重復樣本。

CV(%)=（標準偏差/平均值）×100批內：CV < 10%

批間：CV < 12%

D. 典型數據和標準曲線

提供的典型標準曲線數據僅用于演示目的。必須為進行的每次分析生成新的標準曲線。